Otavan Opiston logoOtavan OpistoNettilukioNettiperuskouluMuikku

Lisämateriaali:

4.3.4 Restriktioentsyymit löydettiin bakteereista

Nykyisin dna:ta katkotaan restriktioentsyymien avulla, joiden käyttöä ei vielä ennen 1970-lukua hallittu. Bioleikkureiksikin sanottujen restriktioentsyymien jäljille päästiin bakteerien avulla. Vuonna 1970 selvitettiin Haemophilus influenzae-bakteerin restriktioentsyymin toimintaperiaate. Aiemmin oli havaittu, että bakteerit suojautuvat vierasta dna:ta vastaan pilkkomalla sen lyhyemmiksi jaksoiksi. Bakteereilla täytyy olla keinot, joilla ne erottavat oman dna:nsa vieraasta dna:sta, muutenhan ne tekisivät itsemurhan hajottamalla oman genominsa. Niin sanottu restriktio- ja modifikaatiojärjestelmä bakteereilla onkin kehittynyt suojaamaan bakteeriin omaa dna:ta ja hajottamaan ulkopuolista, vierasta dna:ta.

Modifikaatioentsyymit metyloivat dna:ta suojatakseen sitä restriktioentsyymien katkaisulta

Käytännössä restriktiosysteemi tulee ilmi, kun faagia siirretään isäntäbakteerista toiseen. Faagin lisääntymiskyky uudessa isännässä on rajoittunut (engl. restricted), kun isäntäkanta vaihtuu toiseksi. Bakteerin restriktioentsyymit pilkkovat aluksi faagi-dna:ta, mutta jonkin ajan kuluttua lisääntymisrajoitteiset faagit sopeutuvat uuteen isäntäänsä ja ryhtyvät lisääntymään siinä tavalliseen tapaansa. Tämä sopeutuminen johtuu siitä, että  faagin dna saa suojaavan metylaation kohtiin, jotka muuten olisivat alttiita katkaisukohtia bakteerin restriktioentsyymeille.

Niin sanotut modifikaatioentsyymit eivät erota omaa ja vierasta dna:ta replikaation jälkimainingeissa. Nämä entsyymit suojaavat vieraankin dna:n, mikäli vain sopiva kohdejakso löytyy. Katkaisevat restriktioentsyymit sen sijaan erottavat dna:n metylaatioasteen perusteella oman dna:nsa vieraasta. Vieras dna on normaalisti vähemmän metyloitua kuin oma dna. Jos myös vieras dna on suojattu metylaatiolla, ei sitä enää eroteta omasta.

Tavallisimmin metylaatiossa sytosiinit saavat metyyliryhmän 5'-hiileensä. Näitä metyloituja sytosiineja GC-saarekkeissa on eläimilläkin noin 90 % kaikista metyloiduista emäksistä. Mikä tahansa bakteeriin joutunut vieras dna joutuu samantapaiseen käsittelyyn kuin faagiesimerkissämme.

Restriktioentyymin tunnistus- ja katkaisukohta voivat olla samoja, mutta joskus ne ovat jopa 5000 emäsparin päässä toisistaan, kuten eräillä I tyypin restriktioentsyymeillä.

Eri restriktioentsyymit katkaisevat dna-molekyylin erilaisista emäsjaksoista

Restriktioendonukleaasi merkitsee nukleiinihappojuosteen sisältä katkaisevaa entsyymiä. Eksonukleaasi tarkoittaa juosteen päästä katkaisevaa entsyymiä. Kaikki tunnetut restriktioentsyymit ovat endonukleaaseja.

Restriktioentsyymejä kutsutaan 4-, 5-, 6-, tai 7-pilkkojiksi sen mukaan, kuinka monta emästä niiden katkaisukohtaan sisältyy. Mitä pidempi restriktioentsyymin tunnistusalue on, sitä harvemmin sitä löytyy dna:sta. Sen sijaan 4 emäksen tunnistusjaksoa voi odottaa löytyvän dna:sta suhteellisen usein, keskimäärin joka 256:s nukleotidi (44 ). 6-pilkkojien katkaisukohtia löytyisi 46 eli joka 4096 nukleotidin välein. Pidemmän katkaisukohdan sisällä voi sijaita toisen restriktioentsyymin lyhyempi katkaisukohta. Joillakin entsyymeillä voi olla sama tunnistuskohta, mutta niillä voi olla eri katkaisukohdat. Valitsemalla sopivaa tyyppiä edustava restriktioentsyymi, saa dna-molekyylin katkaistua suunnilleen haluamansa pituisiksi paloiksi.

Niin sanottuja II tyypin restriktioentsyymejä käytetään hyväksi geeniteknisissä, etenkin yhdistelmä-dna-töissä. Näitä entsyymejä on eristetty bakteereista tähän mennessä satoja ja niitä löydetään koko ajan lisää. II tyypin restriktioentsyymin kohde-dna:n on oltava kaksijuosteista, ja jolleivat tunnistus-ja katkaisukohta ole samoja, on niiden oltava ainakin suhteellisen lähellä toisiaan. Tällaiset restriktioentsyymit tunnistavat dna:sta yleensä palindromisen katkaisukohdan, josta ne katkaisevat dna:n symmetrisesti.

Dna:ssa todellisuudessa esiintyviä restriktoentsyymien palindromisia katkaisukohtia ovat esimerkiksi GATC-jakso.

xxxxxGATCxxxxx

xxxxxCTAGxxxxx

Restriktioentsyymin katkaisun tuloksena syntyvät joko tahmapäät (koheesiiviset päät, engl. sticky ends) tai tylpät päät (engl. blunt ends). Tahmapäät pystyvät takertumaan komplementaarisesti toisiinsa ikään kuin palapelin osaset. Tylpät päät sen sijaan eivät pysty takertumaan toisiinsa kiinni komplementaarisesti.

On kuitenkin olemassa muuan entsyymi (terminaalideoksinukleotidyylitransferaasi), jonka avulla tylpät päät ovat muutettavissa tahmapäiksi. Tämän ligaasi-entsyymin avulla lisätään  komplementaariset, yleensä A- ja T-hännät tylppiin päihin. Myös eräs faagiperäinen entsyymi,  T4-faagin ligaasi, kykenee liittämään tylpät päät sellaisenaan.

Niin sanottujen liittimien (engl. linker) avulla voi liittää myös tylpät päät toisiinsa tai johonkin muuhun molekyyliin. Liittimet ovat keinotekoisia lyhyehköjä dna-jaksoja, joihin voidaan sisällyttää restriktioentsyymien katkaisukohtia. Liittimiä käyttämällä voi samalla varmistaa, että siirrettävä geeni tulee asennetuksi oikein päin kohde-dna:han. Geenin ilmenemisen kannalta voi olla ratkaisevaa, että geenin alkupää tulee vastaanottajassa sijaitsevasta käynnistäjästä alavirtaan 5' - 3' -suuntaisesti. Sitä paitsi kaksi eri liitintä eivät voi takertua toisiinsa, joten näin vältytään lineaaristen juosteiden renkaiksi sulkeutumisilta.

Restriktioentsyymit mahdollistavat nykyisen geenitekniikan sovelluksineen. Restriktioentsyymejä käyttäen on  mahdollista katkoa eri eliöstä peräisin olevaa dna:ta ja yhdistää katkotuista osista koostuva yhdistelmä-dna-molekyyli.

Kaupan oleviin restriktioentsyymien valikoimiin voit tutustua tästä.

© Otavan Opisto / Rosa Venäläinen

© 2015 Otavan Opisto